流式細胞儀是通過內置的激光器發射激光激發熒光染料，即被488nm或其它特定波長的光激發后，發射出另一特定波長的發射光，并通過光電倍增管或光電二極管將光信號放大轉變為電信號或數字信號，并由計算機統計處理為可讀數據。

用激光束激發兩種或兩種以上熒光染料而發出不同波長的熒光，從理論上講，可以選擇光學組件將它們分開，僅使一種熒光被一種熒光探測器收集處理，而檢測不到另外一種熒光。但實際上由于熒光素的發射波長是正態或偏正態曲線，即有很寬的范圍，熒光素之間的波譜常有重疊現象，如下圖1-1所示。由此，我們需要進行補償調節，補償的強度將隨著各熒光探測器的放大倍數（電壓）的變化而變化，特定的電壓對應特定的補償參數。

圖1-1  FITC和PE發射光譜

對于熒光補償的確定，需運用以上補償的基本原理并結合特定的標本來實現。以FITC,PE雙色分析為例：

（1）先調節陰性對照管：將原補償清零，首先調節電壓，通過調節電壓，使陰性群落在FITC和PE雙陰性區。

（2）FITC單染管：在理想情況下（沒有熒光干擾），因檢測管中不應該出現PE信號，但實際情況是在FITC與PE的雙陽性區出現了熒光信號。這個信號就是PE探測器檢測到的FITC信號。此時需要通過調節補償參數，取合適的補償強度來抵消PE中的信號。如下圖所示，調節補償（PE- %FITC ),使得兩群細胞FL2的Mean/Median值相同或相近，或通過經驗判斷（原則為“橫平，豎直”）。當PE探測器檢測到的FITC信號恰好完全消除時，即PE信號與陰性對照一樣時，PE對FITC的補償調節完成。

（3）PE單染管：同理，將進入FITC探測器的PE信號通過補償調節來消除。 

（4）當設置好以上補償條件后，即補償調節完畢。

圖1-2 FITC和PE通道補償調節

圖1-3 補償不足和過補償的雙參數點圖

補償調節抗體的正確選擇對于熒光通道之間的補償調節是非常重要的。要求選擇的抗體所結合的抗原分子在樣本細胞中有明確表達，占樣品細胞的10%以上，50%以下。如果陽性細胞比例太低，在陽性細胞區域無法形成明顯的細胞團，無法判斷調節是否合適。如陽性細胞比例過高，則不表達該抗原的陰性細胞無法形成明顯的細胞團，如圖1-4直方圖所示。

圖1-4直方圖