pBApo-EF1α-neo載體基本信息
載體名稱: | pBApo-EF1α-neo |
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質粒類型: | 哺乳動物細胞表達載體 |
高拷貝/低拷貝: | 低拷貝 |
克隆方法: | 限制性內切酶,多克隆位點 |
啟動子: | EF1α |
載體大小: | 5167 bp |
5' 測序引物及序列: | -- |
3' 測序引物及序列: | -- |
載體標簽: | 無標簽 |
載體抗性: | 氨芐青霉素 |
篩選標記: | 新霉素(Neomycin) |
克隆菌株: | TOP10, DH5α, JM109 |
宿主細胞(系): | 常規細胞系,293、CV-1、CHO等 |
備注: |
pBApo-EF1α-neo載體可用來表達microRNA和其它轉錄產物; 很容易將{promoter+ORF+PolyA signal}框轉移到腺病毒 載體上,用于構建腺病毒載體。 |
產品目錄號: | 3243 |
穩定性: | 瞬表達 或 穩表達 |
組成型/誘導型: | 組成型 |
病毒/非病毒: | 非病毒 |
pBApo-EF1α-Neo DNA是一種簡單的應用于哺乳動物細胞的基因表達載體。該載體具有人多肽鏈延伸因子基因來源的啟動子 (EF1α promoter)、單純皰疹病毒胸苷激酶來源的polyA信號、新霉素抗性基因。通過在MCS區域插入目的基因的開放閱讀框 (ORF),構建目的基因表達載體。除了通常的基因以外該載體可以用于pri-microRNA的轉錄。此外,還可以很容易地將 (promoter+ORF+PolyA signal) 從這個載體上轉移到腺病毒載體上,尤其是轉移到Adenovirus Dual Expression Kit (Code No.: 6170) 的組分pAxcwit上。腺病毒載體感染效率高,范圍廣,可以用于體外和體內的基因轉導。
使用方法
1. 插入基因
在質粒載體的克隆位點處插入目的基因的開放閱讀框(ORF)。因為載體上有氨芐青霉素抗性基因,可以從大腸桿菌中篩選重組體。
2. 轉染
使用 TransIT 系列、Xfect 系列(Clontech)等轉染試劑將質粒導入細胞內。轉染條件請參考轉染試劑的實驗流程。
3. 轉染細胞的篩選
pBApo-EF1αNeo DNA 具有新霉素抗性基因、pBApo-EF1αPur DNA 具有嘌呤霉素抗性基因,可以利用***篩選轉染細胞。
在質粒轉染后培養 24 小時以上,開始使用***篩選。在細胞密度較高的情況下,可以適當地稀釋細胞后重新培養。每 3~4 天更換含***的培養基。通常 1~2 周可以獲得轉染細胞的克隆。由于不同細胞對***的耐藥性不同,需要研討適合的***濃度。通常 NeoR(新霉素)濃度為 500~1,000 μg/ml,PurR(嘌呤霉素)濃度為 1~3 μg/ml。
4. 置換表達框(unit)
pBApo-EF1α系列載體經過 Cla I 或 EcoR V 酶切,將表達框(unit)(EF1a promoter+插入基因+PolyA signal)從質粒中切出,可以輕易地轉移至其他載體上。特別是 Adenovirus Dual Expression Kit(Code
No. 6170),該載體多克隆位點上有 Cla I 和 Smi I 酶切位點,可以很輕易地將表達框轉移至腺病毒載
體上。(EcoR V 和 Smi I 都產生是平滑末端,適合片段與腺病毒載體連接)