l 傳統手工計數方法

ELISPOT檢測的*終數據是細胞頻率（即在細胞群體中，受某種特異性抗原刺激而分泌某種細胞因子的陽性細胞占細胞總數的比例）。細胞總數在試驗開始已經計數。需要統計的是陽性細胞（也稱斑點形成細胞（spot forming cells，SFC）數目。根據以前的技術研究，科學界已形成共識，每一個ELISPOT斑點對應**一個陽性細胞。所以ELSPOT數據處理*重要的工作就是進行斑點計數。

手工計數一般是使用雙筒解剖鏡，在放大25倍的解剖鏡下，一個孔的底板剛好覆蓋一個完整的視野。實驗操作人員手持按壓式的計數器，對孔內的斑點逐一計數。手工計數*大的優點就是可以利用人腦的智慧與經驗：比如可以適應各種大小的斑點，排除各種假陽性的斑點，能辨認復雜背景下的模糊斑點，等等。如果實驗者只是偶爾小規模的做一做ELISPOT，手工計數仍然是優選。但是手工計數也有致命的弱點。

l 手工計數效率低下、工作乏味，不能適應高通量篩選

假設一個ELISPOT孔有200個斑點（這不能算多，一個孔可以容納上千個斑點），計數前先要定位，接著要對焦，對焦完成之后要計數至少兩遍（以保證數據的可靠性）。保守估計，這樣一個孔的計數與處理工作需要10分鐘。那么整塊板96個孔完成數據處理需要960分鐘，也就是大約兩個工作日。如果同時做5塊板的檢測，那么光是*后的數據處理就需要十個工作日，也就是兩周時間！此外，手工計數工作本身的單調、機械和重復，也是常人無法長時間忍受的。

作為對比，BioReader 4000完成一個孔只需要6-7秒鐘，完成一塊板需要10分鐘，完成五塊板的數據分析并且打印出詳細的結果報告也僅僅需要1小時。

l 手工計數很難保證統一的標準

我們知道，在斑點計數之前先要設定一系列的判定標準。比如斑點的形狀，圓形度，邊緣至中心的漸變梯度，半點的直徑，斑點與背景對比度，等等。然后再應用相同的標準對所有的孔，包括實驗孔與正負對照孔進行計數。這樣才能給出公正客觀的結果，避免出現事實上的“雙重標準”。但是我們知道，人的主觀性隨意性很強。即使并非出于故意，在執行標準的時候，也難保自始至終能夠執行統一標準而不走樣。

作為對比，BioReader 4000可以設定各種參數與判定標準，這些參數與標準可以保存成單一的“方法文件”保存或者通過E-mail傳遞，任何時候、任何地點都能保證相同的讀板標準。

l 機器計數可以獲得斑點大小分布信息，手工計數做不到

從前面的1.2節我們知道，同種細胞受同種刺激物刺激，斑點大小服從正態分布。但是細胞或者刺激物任何一種改變都會導致不同種類的斑點產生，這就有可能在同一孔內出現兩種或者兩種以上的斑點。

為了便于說明問題，我們來看一個實際例子。如圖8.1所示，這是某位乙肝病人用HBcAg刺激的ELISPOT結果。A是負對照，不加HBcAg刺激也出現了較多斑點。B是用HBcAg刺激的結果，斑點數目是增加了，但是差別不顯著。如果僅僅只是斑點計數的話，如圖D表格的倒數**行所示，負對照比實驗孔，斑點總數為189：380，相差只有一倍。

但是仔細對比圖A、圖B，我們發現，圖B中似乎有兩種斑點，一種是和圖A相同小斑點，此外還有一些大的斑點。借助于機器，我們可以輕松獲得A、B孔中的斑點直徑分布圖，圖C。從圖C我們可以知道，原來實驗孔中真的有兩種斑點，分別對應正態分布圖中的兩個峰。兩個峰的分界點在100μm處。小于100μm的斑點與負對照孔相同，是非特異性斑點，屬于細胞自發產生；大于100μm的斑點是特異性斑點，由HBcAg刺激產生。

由于有了充足的信息與理由，我們可以在*后斑點計數的時候，把斑點直徑的閾值設定為100μm：我們只計數大于100μm的斑點，小于100μm的斑點不予計數。這樣負對照孔與實驗孔的*終結果為3：50，相差有17倍！這比*初相差一倍的結果顯著得多。

以上的例子說明，某些場合ELISPOT圖像分析儀可以提供額外的重要信息，這是手工計數完全無法做到的。 

l 機器計數可以獲得細胞因子相對定量信息，手工計數做不到

我們知道，通過ELISPOT斑點計數可以提供陽性細胞頻率的數據。也就是說，在給定細胞群體當中，我們可以知道有多少細胞在分泌細胞因子。但是另一方面，我們也希望知道這些細胞分泌細胞因子的相對數量。尤其是在經過某些處理的情況下，陽性細胞的頻率沒有變化，但是細胞的平均分泌量增加了。我們也希望ELISPOT檢測能夠提供這方面的數據。這種數據的獲得就依賴于ELISPOT 圖像分析儀的斑點光密度分析功能。手工計數是無法獲得的。

那么，如何來確定每個斑點代表的細胞因子數量呢？顯然斑點的面積可以作為一個度量，細胞因子分泌越多，斑點就越大。反之亦然。另外，斑點顏色深淺（也稱為：光密度）也可以作為一個度量，細胞因子分泌越多，斑點顏色就越深，反之亦然。打一個簡單的比方，把一個斑點比作一座山峰，斑點的面積就是山峰的占地面積，斑點的深淺就是山峰的高度，細胞因子的總量就是山峰的體積。那么經過一個簡單的數學微積分處理，就可以根據每個面積單元的高度而把山峰的重體積積分出來。ELISPOT斑點光密度定量就使用的這個原理。

如圖8.2所示，這是BioReader 4000光密度分析報告。它可以提供的信息有：孔的位置、每孔的斑點數目、該孔斑點的平均光密度（Average Opt. Density）、該孔斑點的總面積（Cumulated values area）、該孔相對細胞因子分泌總量（TOD，即光密度總值）。

需要指出的是，光密度分析只能提供細胞因子分泌量的相對值，而不能提供細胞因子的**分泌量。原因是很顯然的，諸多因素都對斑點的大小和顏色的深淺有影響。所以我們只能通過同一次實驗，在實驗條件完全相同的情況下，比較不同細胞、不同刺激物或者不同處理帶來的細胞因子分泌量的相對變化。