可能很多讀者對細胞的凍存復蘇的實驗操作與步驟心存疑慮，在這里給大家介紹一些關于細胞凍存復蘇方面的理論知識。

基本概念：存活率與恢復率

細胞凍存復蘇的質量可以通過存活率（viability）來衡量。即在細胞復蘇、洗滌后，用臺盼藍進行細胞計數。存活率 = 活細胞數 / 細胞總數×100%。經臺盼藍染色，活細胞呈無色，晶瑩透亮；死細胞呈藍色，暗淡無光，直徑比活細胞大1-2倍。

一般來說，如果細胞的存活率低于70%，ELISPOT檢測結果會很糟糕。補救辦法是讓細胞休息過夜，或者采用預孵育ELISPOT方法（見4.6節），檢測結果會有改善。如果細胞存活率高于80%會獲得較滿意的ELISPOT結果。如果嚴格按本實驗規范，可以保證存活率達90%。在此存活率下，復蘇細胞可以直接做ELISPOT檢測，不需休息過夜。

與存活率相關聯但又有顯著區別的另一個概念是恢復率（recovery）。恢復率是指凍存、復蘇之后回收到的活細胞和凍存前活細胞的比例。恢復率的高低取決于兩個影響因素，即存活率和洗滌丟失比例。使用本試劑盒，細胞的存活率很高，它對恢復率的影響可以忽略。所以對恢復率的主要影響因素是洗滌過程中細胞的丟失。本操作手冊中有兩步洗滌，推薦的離心條件是400g離心10min，按照這種操作，細胞的丟失應該在可接受的范圍之內。同時我們推薦較高的細胞凍存濃度，即1x107cells/ml，甚至可以更高。如果細胞達不到這種濃度，也至少應該達到5×106cells/ml。

細胞為什么會被凍死？

使細胞死亡的原因并不是低溫，相反，低溫可以減緩甚至暫停細胞生命運動，使其長期保存。讓細胞死亡的真正原因是水。不錯，正是水分。水分在冷凍的過程中會結冰，從而給細胞帶來雙重傷害。

**重傷害在于水結冰的過程。我們知道，冰是一種晶體。結冰的過程，就是水分子不斷的填充到冰晶的陣列當中，使冰晶體不斷長大的過程。看過水晶的人對晶體都會有一種直觀認識，那就是晶體有非常分明的棱角，冰晶也是這樣。不論是細胞內、還是細胞外的冰晶，在生長過程中能夠不斷的外延，很容易就會刺破細胞的各種生物膜，尤其是質膜，從而導致細胞死亡。這是細胞被凍死的首要原因。

**重傷害機制很好理解，那就是水在結冰的過程中，體積會增加1/10。體積膨脹伴隨的微觀運動會使各種水合蛋白原子之間發生位移，化學鍵被扭曲，導致蛋白變性失活。各種蛋白制劑要避免反復凍融就是這個道理。體積膨脹伴隨的宏觀運動會使各種封閉的細胞器、細胞核乃至整個細胞也跟著膨脹，有可能在膨脹過程中發生生物膜破裂事件。由水的體積膨脹導致的傷害相對來說居于次要地位。

這兩重傷害是如此的嚴重，以致于脆弱的哺乳動物細胞如果不添加保護劑，幾乎都會在凍融的過程中死亡。那么，凍存保護劑又是什么東西呢？

凍存保護劑的原理是什么？

凍存保護劑分兩類，保護原理各不相同。**類稱為細胞外保護劑，多是高分子物質，比如甲基纖維素，聚乙二醇（PEG），血清白蛋白等等；**類稱為細胞內保護劑，比如甘油、二甲基亞砜（DMSO）等等。

**類保護劑的作用是分隔細胞外的溶液空間，阻止細胞外大冰晶的形成。因為細胞外保護劑都是高分子，一方面自身會結合大量自由的水分子，另一方面也會阻止未結合的自由水分子的運動，形成一個個相對阻隔的小空間。冰晶的形成與生長就被限定在這樣一個個相互阻隔的小空間內，不能形成大的冰晶。也就是說，把原先少數大的冰晶分隔成了無數細微的小冰晶，極大地減少了對細胞膜的威脅。

**類保護劑能進入細胞內，起到雙重保護效果。**重保護效果是保護細胞蛋白質，減輕凍融作用對蛋白質的損傷。因為內保護劑都是親水的小分子，可以取代蛋白質表面的水合層，減輕水凍結膨脹造成的原子位移與化學鍵破壞。**重保護是破壞細胞內冰晶的晶格結構，防止形成大的冰晶刺破細胞器與質膜。我們知道，晶體的生長是組成晶格的原子分子有序點陣堆積的結果。但是進入細胞內的這些親水小分子可以取代水分子而堆積到冰晶的晶格中，造成晶體的結構缺陷。缺陷嚴重到一定程度，晶體就不再增長，對細胞結構的破壞也就降低了。另外還有證據表明，像DMSO可以起到水的結晶核作用，大量的結晶核相互競爭水分子，導致這些冰晶都長不大。

U-Cytech Cryostar?凍存試劑是各種凍存保護劑的優化與集大成者。重懸液中含有多種細胞外保護劑，2倍凍存液含同時含有細胞外凍存保護劑和細胞內凍存保護劑，可以保證凍存的*佳效果。

為什么要慢凍快融？

除了凍存保護劑之外，冷凍和升溫的速度也直接影響細胞的存活率。做過細胞凍存復蘇的人都可能聽說過“慢凍快融”的原則。這條原則背后的科學道理是什么呢？

慢凍是為了減少細胞內的水分，從而降低水分結冰導致的傷害。為了說清這個道理，需要一點點物理學知識。我們知道，水溶液結冰是一個溶質溶劑相互作用的過程。溶液的濃度越高，開始結冰的溫度（冰點）就越低。溶液結冰時，作為溶劑的水優先結冰，同時把溶質外排，這樣就導致溶質的濃度越來越高。溶質的濃度越高，則剩下的溶液要進一步結冰，需要的溫度就更低，直到一個*終完全結冰的溫度（共熔點）。也就是說，水溶液的結冰是一個溫度逐漸降低（從冰點*后降低到共熔點）、溶液濃度逐漸升高的過程。

但是這樣的結冰過程也是有條件的，那就是外界的溫度不能急劇降低，讓溶劑結冰的時候，有足夠的時間把溶質排除到冰體之外。否則，溫度降低太快，溶質就會被困在溶劑中間一同凝固，這在物理學上叫玻璃化凝固，而非真正的結冰。慢凍就是為了讓凍存液真正結冰，結冰的過程中，凍存液的濃度會逐漸提高，滲透壓也逐漸提高，細胞內的水分就會逐漸滲透到細胞外，從而減弱細胞內水分結冰導致的傷害。

理論和實踐表明，細胞冷凍的速度控制在每分鐘降低1°C效果*好。Nalgene公司的程序降溫盒“Mr. Frosty”放置在-70℃冰箱內能夠提供接近于1℃/min的降溫速度。此外還有專門的程序降溫儀也能嚴格控制凍存細胞的降溫速率。我們不推薦任何傳統辦法，傳統辦法的人為因素太大，效果不穩定。

那么快融又是什么道理呢？快融是為了防止融解過程中的局部區域發生反復凍融。

 DMSO的特殊性所帶來的特殊實驗操作

二甲基亞砜（DMSO）是一種有效的細胞內保護劑，Cryostar? 2×凍存液含有DMSO。DMSO具有脂溶性，細胞毒性，密度比水大。正是由于這些特殊性質，所以在細胞凍存復蘇中會有一些相應的特殊操作。

先說脂溶性。DMSO能自由穿越細胞的脂質雙分子層。穿透的速度取決于細胞內外兩側的濃度差。如果穿透速度太快，膜結構與膜蛋白都會受到損傷。所以，要控制細胞內外的DMSO濃度差，不能變化太劇烈。一方面，滴加凍存液時，DMSO的濃度要緩慢增加；另一方面復蘇洗滌時，DMSO的濃度要緩慢下降。這就是在凍存和復蘇程序中多處出現“逐滴加入”“緩慢加入”的原因。

接著說毒性。沒錯，DMSO確實有細胞毒性！但是它在凍存中能有效保護細胞，所以凍存液都離不開DMSO，我們要做的只能是減少DMSO對細胞的毒性。我們都知道，溫度越低，細胞的生命活動越弱，對有毒物質的耐受就越強。凡是涉及到DMSO的地方我們都會提到“冰上操作”，用低溫來減弱DMSO的毒性，這就是原因所在。

*后說密度。DMSO的密度大于水。Cryostar? 2×凍存液含有DMSO，所以它的密度大于普通培養基和血清。為了獲得充分的混合效果，一方面，在凍存程序中，Cryostar? 2×凍存液要滴加到Cryostar?重懸液液面之上，這樣高密度的Cryostar? 2X凍存液就能靠重力的作用和下面低密度的Cryostar?重懸液有效混合；另一方面，在復蘇程序中，低密度的血清和RPMI-1640培養基要緩慢加入到高密度凍存液液體的下方，這樣低密度的液體靠浮力作用就能和上方的細胞凍存液有效混合。